Руководства, Инструкции, Бланки

Бланк Анализа Пцр Скачать img-1

Бланк Анализа Пцр Скачать

Категория: Бланки/Образцы

Описание

ПЦР в реальном времени, Ребриков Д

ПЦР в реальном времени, Ребриков Д.В. Саматов Г.А. Трофимов Д.Ю. 2009


ПЦР в реальном времени, Ребриков Д.В. Саматов Г.А. Трофимов Д.Ю. 2009.

В книге рассмотрены различные варианты и особенности оборудования для проведения ПЦР «в реальном времени». Разобраны особенности систем флуоресцентной регистрации накопления ДНК. Рассмотрены ключевые факторы, определяющие выбор последовательности олигонуклеотидов и параметры программ амплификации. Уделено внимание подготовке проб и особенностям анализа получаемых данных. Отдельные главы посвящены применению ПЦР «в реальном времени» для решения различных задач: определения уровня представленности транскриптов, вирусной нагрузки, нуклеотидного полиморфизма, относительного содержания нуклеиновых кислот на примере ГМО.
Для сотрудников генно-инженерных и медицинских диагностических лабораторий, а также для преподавателей и студентов, специализирующихся в области молекулярной биологии.

ИЗОБРЕТЕНИЕ ПЦР.
В последние годы все больше молекулярно-биологических методов находят практическое применение в различных областях медицины, промышленности и сельского хозяйства. Один из таких методов — полимеразная цепная реакция (ПЦР), позволяющая нарабатывать в пробирке определенный участок молекулы дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) практически в неограниченных количествах.

В медицине ПЦР применяют при диагностике инфекционных и наследственных заболеваний, при диагностике рака и иммунных патологий. ПЦР используют для идентификации личности и определения биологического родства индивидов. Санитарно-эпидемиологические службы используют ПЦР для контроля за микробиологическим загрязнением окружающей среды и продуктов питания, а также для выявления генетически модифицированных источников пищи (ГМИ). В научно-исследовательских лабораториях ПЦР используют для изучения нуклеиновых кислот и проведения манипуляций с ними. Например, благодаря ПЦР стало возможным быстрое получение исследуемых участков ДНК в чистом виде и в достаточном количестве.

ОГЛАВЛЕНИЕ
Предисловие Л.А. Остермана
Предисловие Е.Д. Свердлова
Список сокращений
Перечень компаний, упомянутых в тексте
Глава 1. Что такое ПЦР
1.1. Изобретение ПЦР
1.2. Изобретение ПЦР «в реальном времени»
1.3. Отличие анализа продуктов ПЦР «по конечной точке» и «в реальном времени»
1.4. Развитие ПЦР «в реальном времени»как диагностического инструмента
Глава 2. Основы полимеразной цепной реакции
2.1. Общие сведения о ПЦР
2.2. Организация НЦР-лаборатории
2.3. Оборудование и материалы для ПЦР
2.4. Свойства олигонуклеотидов (праймеров и проб)
2.5. Влияние ионов Mg2+
2.6. Свободные дезоксирибонуклеотидтрифосфаты (dNТРs)
2.7. Влияние pH
2.8. Минеральное масло
2.9. Другие компоненты, добавление которых влияет на ПЦР
2.10. Ферменты, используемые в ПЦР
2.11. Программы амплификации
2.12. «Горячий старт» (hot start)
Глава 3. Оборудование для ПЦР «в реальном времени»
3.1. Устройство детектирующих амплификаторов
3.2. Основные функциональные узлы
3.3. Обзор характерных разновидностей приборов
3.4. Тенденции развития оборудования для ПЦР «в реальном времени»
Глава 4. Визуализация накопления ДНК при проведении ПЦР «в реальном времени»
4.1. Флуоресценция
4.2. Флуорофоры
4.3. Гасители флуоресценции
4.4. Неспецифичные системы детекции
4.5. Специфичные системы детекции
Глава 5. Дизайн праймеров и проб, программы амплификации
5.1. Параметры, влияющие на взаимодействие олигонуклеотида и ДНК
5.2. Выбор последовательности проб
5.3. Программное обеспечение для дизайна праймеров и проб
5.4. Особенности систем праймеры проба
5.5. Особенности программ амплификации для ПЦР «в реальном времени
Глава 6. Особенности очистки нуклеиновых кислот для ПЦР «в реальном времени»
6.1. Общие принципы очистки нуклеиновых кислот для использования в ПЦР
6.2. Особенности взятия биоматериала для клинических ПЦР-исследований и риск контаминации
6.3. Особенности методов очистки НК для ПЦР «в реальном времени»
6.4. Типовые ошибки использования ПЦР «в реальном времени», связанные с количеством нуклеиновых кислот, забираемых в реакцию
Глава 7. Анализ данных ПЦР «в реальном времени»
7.1. Методы и средства анализа графиков накопления ДНК
7.2. Простая модель ПЦР
7.3. Связь флуоресцентного сигнала и накопления ДНК в ходе ПЦР
7.4. Пороговый метод сравнения графиков накопления ДНК (Ct)
7.5. Определение эффективности ПЦР
7.6. Недостатки порогового метода и пути их преодоления
7.7. Методы прямого сравнения графиков накопления ДНК(СР)
7.8. Комбинация методов Ct и Ср
Глава 8. Определение уровня представленности транскриптов
8.1. Организация эксперимента
8.2. Абсолютное определение уровня представленности транскриптов
8.3. Относительное определение уровня представленности транскриптов
8.4. Нормировка данных
8.5. Внутренний контрольный образец
8.6. Отрицательный контрольный образец
Глава 9. Количественное определение вирусной нагрузки
9.1. Количественное определение вирусной нагрузки
9.2. Источники погрешностей и варианты учета потерь и эффективности реакции
Глава 10. Использование ПЦР «в реальном времени» для определения однонуклеотидного полиморфизма
10.1. Однонуклеотидный полиморфизм последовательностей ДНК
10.2. Идентификация ОНИ с помощью аллель-специфичных праймеров
10.3. Дифференциация аллелей с помощью олигонуклеотидных проб
10.4. Генотипирование ОНП методом плавления ДНК-дуплексов
Глава 11. Определение относительного содержания нуклеиновых кислот на примере генетически модифицированных источников
11.1. Общие сведения о ГМИ
11.2. Классификация существующих методов определения ГМИ в продуктах питания
11.3. Организация чужеродной ДНК в геноме растений
11.4. Выбор последовательностей-мишеней для выявления чужеродной ДНК в геноме растения
11.5. Тест-системы для определения процентного содержания чужеродной ДНК относительно геномной ДНК растений
11.6. Выбор чужеродной и нормировочной ДНК для количественного определения ГМИ
11.7. Калибровочные образцы
11.8. Точность метода определения процентного содержания генетически модифицированных ингредиентов в пище с помощью метода ПЦР «в реальном времени»
Предметный указатель.


Бесплатно скачать электронную книгу в удобном формате и читать:

Видео

Другие статьи

Анализ крови на ПЦР – что это такое, суть метода, показания к назначению, расшифровка анализа крови ПЦР

Что такое анализ крови на ПЦР, и зачем он нужен

Диагностика инфекционных заболеваний – бактериальных и вирусных – направлена на раннее выявление возбудителей, что позволяет назначать раннюю и максимально эффективную терапию. Самым современным способом диагностики инфекций является ПЦР или полимеразная цепная реакция. Так что же это за метод, и для чего он нужен?

Суть полимеразной реакции

Любой микроорганизм и вирус содержат в своей структуре молекулы ДНК или РНК. У каждого из них эти соединения уникальны, поэтому, если выделить в анализе крови у детей или взрослых нуклеиновые кислоты, можно с абсолютной точностью поставить диагноз.

К сожалению, концентрация ДНК в образцах крови или других биологических материалах достаточно низка и с помощью обычных методов диагностики определить ее не получается. Чтобы справиться с этой проблемой, была изобретена полимеразная цепная реакция.

Сущность ПЦР заключается в специальной обработке образца крови, в результате чего в ней увеличивается концентрация ДНК молекул, определение типа которых в дальнейшем позволяет установить вид возбудителя и поставить диагноз.

Как сдать кровь на ПЦР

При подготовке к анализу следует придерживаться общих рекомендаций: не пить и не есть непосредственно перед анализом крови. Хотя для сдачи крови на ПЦР можно так строго не придерживаться этих требований, так как точность исследования не зависит от того, на сытый или голодный желудок был взят анализ.

Какие заболевания можно выявить с помощью ПЦР

С помощью ПЦР можно выявить практически любые вирусные и бактериальные заболевания. Для анализа используется не только кровь, но и другие биологические материалы: сперма, слюна, мазки из уретры и с шейки матки. Анализ крови будет информативен в том случае, если возбудитель конкретного заболевания проникает в кровь человека. Поэтому ПЦР крови назначают при следующих заболеваниях:

  • вирусные гепатиты А, В, С, D и TT;
  • цитомегаловирус;
  • герпетическая инфекция (вирусы герпеса 1, 2 и 4-го типов);
  • ВИЧ-инфекция
  • энтеровирусная инфекция;
  • опоясывающий лишай;
  • краснуха;
  • токсоплазмоз;
  • инфекционный мононуклеоз;
  • листериоз.

Если же взять во внимание возможность проведения ПЦР других биоматериалов, то в список заболеваний, выявляемых с помощью ПЦР, следует добавить:

Особо актуально в настоящее время ПЦР анализа крови беременной на так называемые TORCH-инфекции. цитомегаловирус, токсоплазмоз, краснуху и герпесвирусную инфекцию. Связано это с тем, что упомянутые заболевания могут привести к аномалиям развития плода.

Преимущества ПЦР
  1. 100% точность диагностики – если в крови есть даже несколько фрагментов ДНК возбудителя, с помощью ПЦР они буду выявлены, и будет поставлен точный диагноз. Это главное отличие данного метода от других способов диагностики – ИФА, общего анализа крови и прочих.
  2. Специфичность. При проведении ПЦР отсутствует такое понятие, как ложноположительный или ложноотрицательный результат. В отличие от иммуноферментного анализа (ИФА).
  3. Возможность проведения анализа сразу на несколько возбудителей из одного образца биоматериала, что делает метод удобным для пациента – не нужно несколько раз сдавать анализ.
  4. Быстрота. Не нужно выделять и выращивать возбудителя на питательных средах, как это делается при бактериологическом исследовании. Результат может быть готов уже в день сдачи анализа.
  5. С помощью ПЦР выявляют возбудителей латентных заболеваний, когда возбудитель в организме есть, но он еще не вызвал заболевание, или когда пациент является носителем инфекции (гепатита или ВИЧ).
  6. Низкая стоимость. Цена анализа ПЦР на одного возбудителя составляет 250-500 рублей. Чуть дороже стоит полуколичественный анализ на вирусы – около 1000 рублей.
Недостатки анализа

ПЦР является высокотехнологичным методом исследованием и предъявляет высокие требования к оснащению лаборатории. Помещение, где делают анализ, обязательно должно быть оснащено фильтром биологической очистки, так как в воздухе постоянно присутствуют частицы кожи, слюны, содержащие в своем составе молекулы ДНК. Несоблюдение техники работы с биоматериалами может стать причиной неверного результата.

Анализ крови – расшифровка у взрослых (ПЦР)

Трактовка результатов этого исследования не представляет сложностей, потому что отсутствует таблица норм анализа крови на ПЦР. В бланке результатов могут фигурировать лишь две фразы:

  • отрицательный результат – возбудитель, на который проводился анализ, не выявлен;
  • положительный результат – в организме имеется возбудитель указанного заболевания.

Следует знать, что ПЦР может быть положительной даже при отсутствии клинических симптомов заболевания! Расшифровка анализа крови на ПЦР у детей не отличается от таковой у взрослых.

Кому нужно сдать анализ на ПЦР

Любой человек может сдать кровь для исследования. Прямым показанием для исследования является подозрение на инфекции передающиеся половым путем (хламидиоз. гарднереллез, ВИЧ-инфекция). При случайном незащищенный половом контакте только ПЦР поможет поставить диагноз на ранней стадии, если человек заразился каким-либо заболеванием. В обязательном порядке кровь на TORCH-комплекс сдают беременные женщины. А также женщины, только планирующие беременность .

Хотя ПЦР является максимально эффективным методом диагностики, зацикливаться только на нем не стоит. Обследование пациента при любом заболеваний должно носить комплексный подход. Если цепная полимеразная реакция позволяет выявить возбудителя, то серологическое исследование позволяет оценить эффективность лечения, реакцию организма на возбудителя и лекарства. Назначать все исследования должен врач по показаниям.

Увидеть, как выполняется анализ крови ПЦР, вы сможете, просмотрев данный видео-обзор:

Гудков Роман, врач-реаниматолог

2,690 просмотров всего, 17 просмотров сегодня

Лекция 4

/ Гусейнов / Лекция 4.3 ПЦР

Полимеразная цепная реакция - метод лабораторного исследования, который позволяет найти в исследуемом клиническом материале небольшой участок генетической информации любого патогенного возбудителя. Метод основан на открытии американского ученого Кери Маллиса

ПЦР диагностика дает возможность существенно ускорить и облегчить диагностику различных вирусных заболеваний, в частности, хламидиоза, микоплазмоза, уреаплазмоза, гарднереллеза, герпеса и т.п. Вирусные инфекции можно обнаруживать сразу после заражения, за недели или месяцы до того, как проявятся первые симптомы.

Это один из самых распространенных методов лабораторной диагностики, который позволяет благодаря многократному увеличению последовательностей ДНК выявить даже единичные клетки возбудителя.

Происходит копирование только того участка, который удовлетворяет заданным условиям, и только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце.

Метод ПЦР незаменим для выявления латентных и хронических инфекций, так как размножению подвергается только ДНК бактерии, а не сама бактерия. Эта особенность позволяет обнаружить бактерии и вирусы, патогенные человеку, которые невозможно увидеть в мазке или определить методом ИФА. Кроме того, с его помощью можно определить количество копий возбудителя, что очень важно при наблюдении в процессе лечения, так как это позволяет оценить качество терапии.

Высокая специфичность ПЦР обусловлена тем, что в исследуемом материале появляется характерный только для данного вида возбудителя фрагмент ДНК.

Выявляя единичные клетки бактерий или вирусов, ПЦР-диагностика обнаруживает наличие возбудителей инфекционных заболеваний в тех случаях, когда другими методами (иммунологическими, бактериологическими, микроскопическими) это сделать невозможно.

ПРЕИМУЩЕСТВА ПЦР КАК МЕТОДА ДИАГНОСТИКИ

Одним из важнейших критериев диагностической эффективности любого лабораторного анализа является показатель «чувствительности». При этом следует различать аналитическую и диагностическую чувствительность. Аналитическая чувствительность, применительно к ПЦР, представляет собой то минимальное количество копий (геномных эквивалентов-г/э) ДНК или РНК в одном миллилитре раствора образца, которое может быть определено данной тест-системой. Большинство коммерческих амплификационных тест-систем позволяет обнаружить в биологической пробе искомую НК если ее концентрация составляет не менее нескольких сот г/э копий в 1 мл образца. Например, аналитическая чувствительность большинства тест-системы для ВИЧ-1 составляет 300-500 копий ДНК в 1 мл образца. Диагностическая чувствительность определяется количеством пациентов с данным заболеванием, дающих истинно положительные результаты при использовании конкретного набора и оценивается в процентах. В этом аспекте имеется общее положение, определяющее клиническую пригодность любых лабораторных способов диагностики или тест-систем - диагностическая чувствительность метода не должна быть ниже 95-98%.

Второй универсальный критерий лабораторной эффективности – «специфичность», определяется процентом здоровых людей, имеющих истинно отрицательные результаты анализа. Метод ПЦР обладает высочайшей специфичностью, которая достигает 99-100%.
Диагностическая чувствительность и специфичность ПЦР сопоставимы, а зачастую и превосходят таковые, обеспечиваемые культуральным методом, которые являются «золотым стандартом» в диагностике инфекционных заболеваний. Если учесть продолжительность процедуры выращивания культуры клеток (от нескольких недель до нескольких месяцев), то преимущество метода ПЦР становится несомненным. Результаты ПЦР-анализа можно получить в течение одного рабочего дня, при этом отобранные для анализа пробы могут храниться (накапливаться) в течение даже нескольких недель при соблюдении соответствующих температурных норм. Проведенная недавно в нескольких зарубежных исследовательских центрах суммированная оценка чувствительности различных методов диагностики показала, что “быстрые” или экспресс-тесты имеют чувствительность 40-60%, ИФА - 50-70%, прямая иммунофлюоресценция (ПИФ) - 55-75%, культуральное исследование - 60-80%, а ПЦР от 90 до 100%.

Как видно ПЦР, по сравнению с другими способами обладает двумя важными преимуществами: высокой чувствительностью и непродолжительностью по времени анализа, т.е. «актуальностью» получения результата исследования врачом и пациентом.

Таким образом, приведенные выше факты позволили отметить следующие преимущества ПЦР перед другими методами клинической лабораторной диагностики:

1. Универсальность
Метод принципиально позволяет обнаруживать любые ДНК и РНК даже в тех случаях, когда другими способами это сделать невозможно.
Вне зависимости от объекта и области применения ПЦР (клиническая медицина, криминалистика, ветеринария, генетика, молекулярная биология) используется стандартный комплект приборов. Это обуславливает универсальность процедуры постановки ПЦР при исследовании любых биологических объектов.

2. Специфичность
Высокая специфичность (100%) метода обусловлена тем, что в исследуемом материале определяется уникальный фрагмент НК (нуклеотидная последовательность), характерный только для данного возбудителя или гена. Таким образом, ПЦР - диагностикумы дают возможность избежать проблем, связанных с перекрестно-реагирующими антигенами.

3. Чувствительность
Возможность проведения не только качественной (наличие), но и количественной (концентрация) оценки содержания НК. В настоящее время реальный порог’ чувствительности коммерческих амплификационных тест-систем позволяет определять несколько сот копий в исследуемом образце.

4. Актуальность ответа (быстрота получения результата)
Высокая технологичность и автоматизация метода позволяет получить результаты исследования в руки врача и пациента в день проведения анализа.

5. Возможность доклинической и ретроспективной диагностики
ПЦР позволяет осуществить определение патогена или дефектного гена в организме ещё до развития заболевания. Например, при инфекциях в инкубационном периоде, т.е. серонегативной фазе или при латентном характере заболевания. Кроме того, возможно проведение ПЦР в архивном (фиксированном) материале или биологических остатках, что важно для идентификации личности или отцовства.


6. Проведение анализа возможно в минимальном объеме пробы (до нескольких микролитров), что крайне важно в неонатологии, судебной медицине, клинической генетике и т.п.

7. Возможность одновременной диагностики нескольких возбудителей заболеваний или аномальных генов в одной пробе без ущерба для чувствительности или специфичности результата.

8. Возможность экспертизы
Полученные результаты ПЦР возможно вносить в компьютерные информационные носители или фотографии для оценки независимыми экспертами.

Несмотря на вышеуказанные достоинства метод ПЦР все же не лишен некоторых недостатков, которые следует учитывать при оценке результатов исследований.

Главные особенности метода ПЦР :

100% специфичность, т.к. каждый возбудитель имеет уникальный фрагмент нуклеиновых кислот,

возможность определить количество копий возбудителя (позволяет оценить качество терапии),

возможность одновременной диагностики нескольких возбудителей,

быстрота получения результата и полная автоматизация.

Ключевым фактором успешности процесса, является, пожалуй, правильный выбор последовательности праймеров. Можно использовать программы, значительно упрощающие поиск подходящих регионов ДНК или даже выбирающие пару праймеров автоматически (например, "Oligo" от molecular Bioligy Insights).

Метод ПЦР служит основой для дальнейших исследований амплифицированной последовательности:

- гибридизации с аллель-специфическими олигонуклеотидными зондами;

- определения нуклеотидной последовательности;

- исследования экспрессии in vitro с целью поиска мутаций, укорачивающих молекулу белка.

СПАСИБО ЗА ВНИМАНИЕ!

Что такое ПЦР? Суть метода.

История разработки современной методики ПЦР.

Что нового предложил Маллис?

Какие усовершенствования в методике были сделаны в1986 году?

Назовите алгоритм проведения ПЦР.

Участки какой длины можно амплифицировать, используя ПЦР?

Перечислите компоненты реакции ПЦР.

Как действует добавление пирофосфатазы на выход ПЦР?

Что называется праймером ПЦР?

Что называется амплификатором?

С помощью чего можно сделать вывод об успешности проведения ПЦР?

Что называется ампликоном?

Сколько циклов обычно выполняется при проведении ПЦР?

Из каких стадий состоит цикл ПЦР?

В каких сферах деятельности используется ПЦР?

В чем состоит ПЦР-диагностика при определении возбудителя заболевания?

В чём преимущества ПЦР как метода диагностики?

Презентация на тему - ифа пцр - скачать презентации по Медицине

  • инфекция мочевыводяших путей у детей
  • Психиатрия
  • Психиатрия
  • наложение жгута
  • причины невынашивания беременности
  • Общение с депрессивными пациентами и пациентами с суицидальными намерениями.
  • Массаж. Каталог массажистов
  • Автоматизированная система создания программ питания. АРМ для диетолога
  • гормональная контрацепция Cмотреть все презентации по медицине

    33635 33706 33707 33738 33739 33788 33807 33812 33819 33852 33925 33954

  • Методика проведения исследования клинического материала на наличие ДНК возбудителей ИППП методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией - Обор

    Методика проведения исследования клинического материала на наличие ДНК возбудителей ИППП методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ А. Учет результатов при использовании наборов реагентов«АмплиСенс» вариант FEP А1. Учет результатов при использовании ПЦР-детектора «Джин»

    Работа с флуоресцентным ПЦР-детектором «Джин» проводится согласно «Паспорту ПЦР- детектора флуоресцентного «Джин».

    Для детекции и учета результатов используются стандартные настройки тестов программы «Джин», заданные по умолчанию: пороговые значения равны для «- » 1,75; для «+ » – 2,1; для «ВК» – 2,5.

    Настройки теста можно просмотреть выбрав меню «Настройки», «Список тестов» в главном меню программы. Если значения изменены, требуется восстановить начальные значения, указанные выше, и сохранить изменения при выходе из программы.

    1. Включить прибор и запустить программу «Джин» на компьютере, присоединенном к прибору.

    2. Задать протокол измерения. Ввести количество измеряемых образцов (включая фоновые пробирки), выбрать нужную инфекцию в списке тестов в графе «Тест», кликнуть «OK» и ввести последовательность детектируемых образцов (в колонке «Образец»).

    3. В качестве образцов, обозначенных «ФОН» использовать контрольные образцы «Фон ».

    4. Поставить пробирки в ячейки модуля прибора «Джин» в соответствии с заданной последовательностью (группами по 12 образцов) и запустить измерение, кликнув кнопкой мыши значок цветной призмы в панели активных кнопок (вверху экрана). По окончании измерения вынуть пробирки и кликнуть кнопкой мыши кнопку «OK».

    5. Сохранить полученные результаты, выбрав в меню значок сохранения файла (или выбрав вкладку Протокол. затем Сохранить ), и задав имя файла.

    6. Полученные данные интерпретируются программой автоматически (колонка «Результат » на экране). Положительные образцы, в которых обнаружена ДНК анализируемого возбудителя, обозначаются знаком «+ » на красном фоне; отрицательные образцы – знаком « » на зеленом фоне; образцы, для которых получен сигнал, который нельзя однозначно интерпретировать, требующие повторного анализа, обозначены знаком «? » на желтом фоне; и образцы, в которых не детектируется (не превышает фона) как специфический сигнал, так и сигнал ВКО, требующие повторного анализа, обозначены знаком «нд » на желтом фоне.

    7. Результат считается достоверным только в случае прохождения положительных и отрицательных контролей амплификации и отрицательного контроля выделения ДНК.

    Оценка результатов анализа контрольных точек

    ПРИМЕР ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ


    Вывод: образцы 1-3, 5, 6, 9-11 и к+ - положительные, образцы 7, 8, 12 – отрицательные,
    образец 4 – не валидный результат (не детектируется ВКО), требует повторного анализа.

    А2. Учет результатов при использовании ПЦР-детектора «АЛА-1/4»

    Работа с флуоресцентным ПЦР-детектором «АЛА-1/4» проводится согласно «Паспорту ПЦР-детектора флуоресцентного «АЛА-1/4».

    Для детекции и учета результатов используются следующие настройки тестов программы «АЛА-1/4», заданные по умолчанию: пороговые значения для канала FAM1,9 и 2,4 ; для ВКО указана детекция по каналу HEX и пороговое значение 3,0.

    Настройки теста можно просмотреть и изменить, выбрав закладки «Настройки», «Список тестов» в главном меню программы. (Для этого введя указанные выше значения, следует нажать кнопку «Сохранить»).

    1. Включить прибор и запустить программу «АЛА-1/4» на компьютере, присоединенном к прибору.

    2. Задать протокол измерения, выбрав в верхнем меню «Протокол », «Создать новый ». Выбрать тип ротора: 36 х 0,5 при использовании пробирок объемом 0,5 мл или 48 х 0,2 при использовании пробирок объемом 0,2 мл. Выбрать нужный тест в списке тестов в меню. Ввести последовательность детектируемых образцов и фоновых образцов в колонке «Образец». Закрыть окно редактирования протокола детекции.

    3. В качестве образца (образцов), обозначенного «ФОН» использовать контрольный образец (образцы) «Фон ». Для того, чтобы обозначить образец «ФОН» в графе «Образец», используется сочетание клавиш «Ctrl» + «F».

    4. Поставить пробирки в ячейки предварительно снятого ротора прибора «АЛА-1/4» в соответствии с заданной последовательностью, установить ротор в модуль прибора, закрепив его фиксатором и закрыть крышку. Запустить измерение с помощью значка детекции в панели активных кнопок (вверху экрана) или выбрав в меню пункт «Протокол », затем «Детекция ». По окончании детекции на экран будет выведена таблица результатов.

    Примечание: Если в одном протоколе проводится детекция большего числа образцов, чем число ячеек в роторе, то после окончания детекции первой группы образцов (36 или 48) необходимо извлечь ротор, поместить в его ячейки следующую группу образцов, поместить ротор в прибор и для продолжения детекции нажать кнопку «Продолжить» в окне программы. Если пробирки, относящиеся к одному тесту, не помещаются в один ротор, то нужно ставить пробирки «Фон».

    5. По окончании измерений сохранить полученные результаты, выбрав в меню Файл. затем Сохранить как и задав имя файла.

    6. Полученные данные интерпретируются программой автоматически (колонка «1» на экране). Для образцов, в которых обнаружена ДНК анализируемого возбудителя, в соответствующей графе указано «обнаружено » (на лиловом фоне). Для образцов, в которых не обнаружена ДНК данного возбудителя, в соответствующей графе указано «не обнаружено » (на голубом фоне). Для образцов, для которых получен сигнал, который нельзя однозначно интерпретировать (возможно, положительный), указан результат «сомнительно ». Для таких образцов требуется повторное проведение анализа для получения достоверного результата. Образцы, в которых не детектируется (не превышает фона) как специфический сигнал, так и сигнал ВКО, требующие повторного анализа, обозначены знаком «нд » на желтом фоне.

    7. Результат считается достоверным только в случае прохождения положительных и отрицательных контролей амплификации и отрицательного контроля выделения ДНК.

    Оценка результатов анализа контрольных точек

    ПРИМЕР ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ.


    Б. Учет результатов при использовании наборов реагентов«АмплиСенс» вариант FRT

    Полученные данные - кривые накопления флуоресцентного сигнала по двум каналам - анализируются с помощью программного обеспечения используемого прибора для проведения ПЦР в режиме реального времени.

    Результаты интерпретируются на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией. Это соответствует наличию (или отсутствию) значения порогового цикла «Ct» в соответствующей графе в таблице результатов. Анализ и учет результатов проводится согласно описанию в инструкции соответствующей используемому прибору.

    Анализируют результаты амплификации участка ДНК возбудителя и ДНК ВКО. Накопление продукта амплификации участка ДНК возбудителя детектируется по каналу FAM, а накопление продукта амплификации ДНК ВКО - по каналу для детекции флуорофора JOE (или HEX).

    Б1. Учет результатов при работе с прибором «Rotor-Gene 3000» или «RotorGene 6000»

    1. Выбрать в главном меню значок меню «Analysis », в ниспадающем меню выбрать вкладку «Quantitation ». Выполнить эту операцию для данных канала FAM, выбрав в поле «Cycling A FAM », затем для данных канала JOE, выбрав в поле «Cycling A JOE ».

    2. Анализ результатов амплификации ДНК возбудителя, детектируемых по каналу FAM. Щелкнуть кнопкой мыши на графике нормализованных кривых флуоресценции по каналу FAM. В меню над графиком должна быть включена кнопка «Dynamic Tube » (включена по умолчанию). Кнопка «Slope correct » должна быть выключена (выключена по умолчанию). Задать уровень пороговой линии - ввести в текстовом поле «Threshold » значение, указанное в Таблице 1 для данного теста. Нажав кнопку «More Settings », ввести в текстовом поле значение, указанное в Таблице 1 для данного теста. Внизу под графиком появится таблица результатов с указанием значения порогового цикла Ct по каналу FAM для каждого образца («Quant. Resultes – Cycling A. FAM »).

    Параметры учета результатов при использовании прибора «Rotor-Gene 3000».

    Тест для выявления возбудителя

    3. Анализ результатов амплификации ДНК ВКО, детектируемых по каналу JOE. Щелкнуть кнопкой мыши на графике нормализованных кривых флуоресценции по каналу JOE, включить в меню над графиком кнопку «Dynamic Tube » (включена по умолчанию), затем кнопку «More Settings » и ввести в текстовом поле значение 5 (5 %). Задать уровень пороговой линии - ввести в текстовом поле «Threshold » значение 0,1. Внизу под графиком появится таблица результатов с указанием значения порогового цикла по каналу JOE для каждого образца («Quant. Resultes – Cycling A. JOE» ).

    4. Результаты интерпретируются следующим образом:

    А) Образец считается положительным, если в таблице результатов пороговых циклов по каналу FAMQuant. Resultes – Cycling A. FAM ») для него определено значение Ct . При этом кривая флуоресценции данного образца должна пересекать пороговую линию на участке характерного экспоненциального подъема флуоресценции.

    Б) Образец считается отрицательным, если в таблице пороговых циклов по каналу FAM для него не указывается значение Ct (кривая флуоресценции не пересекает пороговую линию), а в таблице пороговых циклов по каналу JOEQuant. Resultes – Cycling A. JOE ») для него пределено значение Ct . не превышающее 28.

    В) Для образцов, для которых отсутствует значение Ct по каналу FAM, и по каналу JOE значение Ct также отсутствует или превышает 28, требуется повторное проведения анализа, начиная с этапа выделения ДНК.

    5. Результат считается достоверным только в случае прохождения положительных и отрицательных контролей амплификации и отрицательного контроля выделения ДНК.

    Оценка результатов анализа контрольных точек

    Контролируемый этап ПЦР-анализа

    Значение Сt по каналу FAM

    Значение Сt по каналу JOE